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流感元凶无处遁形Comments>>

发表于 2009-05-20 22:08 | Tags 标签:, ,

按:在1918年流感大爆发的时候,人们甚至不知道那场瘟疫的真凶究竟长得是什么样子。90年过去了,借助高科技的复合检测手段,流感病毒已经难以遁形。

2009年5月10日,四川省报道了我国内地第一例甲型H1N1流感疑似病例,短短的10个小时之后,此病例被确诊为甲型H1N1流感病例,人们的神经又一次紧绷了起来。

一般来说,甲型H1N1流感患者的症状表现与普通流感患者的症状表现没有很大的区别。在初步检测中,曾到过甲型H1N1流感流行的国家或地区,或与甲型H1N1流感患者有密切接触史(也可流行病学史不详),1周内出现流感临床表现,呼吸道分泌物、咽拭子、痰液、血清H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性,都会被判断为疑似病例。正是依据这些指征,锁定了内地第一例疑似病例。在接下来的10多个小时里,医学检测人员紧张地进行了一系列的实验室检测工作,为确诊提供重要的参考依据。

在卫生部2009年5月8日发布的《甲型H1N1流感诊疗方案(2009年试行版第一版)》中明确指出了四种实验室检测方法:外周血象、血清学诊断、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以及病毒分离。这些近乎繁琐的检查流程,究竟是如何提供指证H1N1流感元凶的证据呢?

血液中的线索

人体血液系统中,除了骨髓之外,流淌在全身血管和组织中的血液都称为外周血,在外周血中,各种血细胞的形状及所占比例会随人的身体状况而发生变化,这些指标被称为外周血象,因此医生可以根据血象对一些疾病做出基本的判断。比如,感染了甲型H1N1病毒的患者的白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少,并伴有血小板降低。有研究人员认为,这些血象表征可能与病毒侵入人体后,机体产生大量的对抗病毒的干扰素有关。

要想知道上述血象变化是不是由流感病毒引起的,就必须进行血清学诊断,以检测血清中存在的病毒抗体。一般会选取2份病人血清,采集时间分别是发病3日内和2~4周,利用免疫学方法测定其中的抗体数量。目前,常用的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫法(IFT)两种。一般来说,在受到病毒侵染后,机体就会产生相应的对抗病毒的抗体。上述两种方法,正是利用检测抗体,而测定疑似患者是否患上流感。

ELISA是一种经典的检测抗体含量的方法,早在1974年就有学者利用这种方法对流感病毒的抗体进行了检测。检测时首先将含有病毒抗体的待测标本(来自于疑似患者的唾液等标本)及与特定酶类联结在一起的相应抗原(如流感病毒的特异蛋白)固定在一种固相载体的表面,并发生抗原抗体结合反应,而这时与抗体偶联在一起的酶能够催化上述载体上的某种物质变为有色产物。由于抗原抗体的结合具有特异性和定量性,因此固定于载体表面的酶的含量与抗体的含量具有一定的比例关系。最终我们就可以根据有色产物颜色的深浅来定性或定量分析病人血清中的抗体。目前ELISA已经成为流感流行病学调查及早期快速诊断的非常有效和实用的方法。

IFT技术的应用要更加久远,1961年就开始用于人类流感的快速诊断。这种技术同样是基于抗原抗体结合反应。首先将标本固定于玻片或塑料孔板等载体之上,然后加入标记有荧光物质的抗原,如果标本中存在相应抗体,那么荧光物质便会随抗原一同与抗体结合。在荧光显微镜下,就可观察到激发产生的荧光。IFT技术用于诊断时具有快速、简便、敏感、价廉的特点,不过需要注意避免和降低非特异性荧光的产生。

2009年5月9日,当第一例甲型H1N1流感前往医院就诊时,通过这种方法,检测出其抗体呈弱阳性,从而将其圈定为疑似病例。血清学诊断在短时间内就可以得到结果,但是这种诊断,只能提供感染病毒的间接证据,无法确认抗体的数量升高肯定是甲型H1N1流感病毒引起的。要想验明病毒正身,还需要做进一步的检测。

受精鸡蛋中的病毒

在很多情况下,患者体内的抗体数量不足以明确其是否感染了特定种类的病毒。在以往的检测中,就需要将患者呼吸道标本中(咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织)分离到的病毒培养扩增,然后再加以分离也能够帮助诊断感染与否。由于病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以无法像细菌、细胞那样在培养基中生长,必须在活细胞内才能增殖。

目前,鸡胚(通俗地说,就是受精后开始发育的鸡蛋)和体外培养的细胞是人工培养病毒的常用场所。鸡胚是正在发育的胚胎,分化程度较低,很多病毒都可以在鸡胚中增殖。这里不仅适于病毒生长繁殖,在培养后,还便于将它们收集分离。并且鸡蛋,还具备来源充足、操作简单的优点。不过,并不是从菜市场里任意拿出一个鸡蛋,都能用来做病毒分离。因为有些鸡胚中就可能携带垂直传播的病毒,所以最好使用无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级的鸡胚。除了检测病毒,鸡胚也是流感疫苗的重要生产场所。

体外培养的细胞(如MDCK犬肾细胞系)是另一种培养分离病毒的常用场所,这种体外培养手段不受机体免疫力的影响,易于很多病毒的生长,此外观察病毒生长特征、收集分离病毒也非常方便。在现有的诊断方法中,病毒分离法是较敏感的,但需要2~3周时间。无法为临床诊断及时提供结果,而且病毒分离阴性并不能排除感染甲型H1N1病毒。

RT-PCR快速"缉凶"

在快速有效检测病毒的迫切需求下,RT-PCR技术应运而生。这种方法不但高效、快速,并且实时RT-PCR(real-time RT-PCR)技术具有更高的灵敏度和特异性,同时,还能进行病毒载量的分析,因此RT-PCR技术是目前首选的流感病毒检测方案。2009年5月5日,我国已成功研制出甲型H1N1流感病毒RT-PCR检测试剂盒,可在1~2天内完成甲型H1N1病毒快速检测。

作为RT-PCR技术的基础,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术已经广泛应用于生物学、医学、法医鉴定等领域,其过程就其过程就是以目的DNA为模板,在体外大量扩增与模板一模一样的DNA。通过高温使双链DNA变性分开成为两条单链DNA,温度降低后,两条引物就会分别和相应的单链DNA结合,为接下来的核苷酸指明组装位置。在此过程中,还需要根据DNA测序结果预先合成一对分别和目的DNA双链的特定区域碱基互补的短序列作为引物。简单来说,DNA特异区域和引物就像拉锁最底部的两个扣子,而聚合酶就像拉锁滑块,不过它拉锁滑块高明的地方就是可以将游离的核苷酸碱基先按顺序连接在引物的后边,再与DNA模板咬合在一起。此后,在高温作用下,新老DNA链再次分离,又开始开头的那些循环步骤。如此往复数十轮后,目的DNA的数量可在2~3个小时内增加上百万倍。

RT-PCR则是PCR技术的进一步发展,如上文所述,PCR反应时利用的模板应是双链DNA,但是有些研究需要从RNA起始(如流感病毒的遗传物质就是RNA),这时利用逆转录酶和RNA模板,先合成出一条RNA模板互补的DNA序列,接下来在合成DNA的另一条链,就可以得到包含与当初的RNA模板遗传信息相同的双链DNA模板。RT-PCR让RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。而广泛用于病毒检测和诊断的RT-PCR技术中的逆转录酶正是在动物致癌RNA病毒中发现的。两位发现者美国科学家特明和巴尔的摩还因此分享了1975年的诺贝尔生理及医学奖。

更精确的测序检测手段

流感病毒具有突变频繁、亚型众多的特点。比如甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1~H16),神经氨酸酶有9个亚型(N1~N9),二者经过排列组合,更是会形成数目繁多的毒株。不过DNA测序手段日新月异,速度更快,精度也更准。当疫情出现时,人们已经可以做到在24小时之内,测出病毒的全基因组序列。通过相互比较不同亚型病毒的基因序列,可以找到每种亚型的特异所在,然后据此进行引物设计。这时引物与相应的病毒就像钥匙与锁的关系,以临床采得的标本为模板,如果PCR反应扩增得到了特定DNA片段,那么就意味着钥匙打开了锁,也就是说标本中含有待检病毒。反之,特定DNA片段没有出现,则可判定标本为阴性。

随着技术的进步,实时定量RT-PCR技术也发展起来,由于其不仅采用了特异性引物,而且采用了特异性荧光探针,这使得该方法的特异性比传统的RT-PCR的灵敏性高出10~100倍,据测算,只要标本中存在100个流感病毒的RNA分子(大约10-15克),即会被敏锐地察觉到。这大大减少了非特异性扩增造成的假阳性结果。此外全封闭反应的荧光RT-PCR技术是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号,实现了对PCR扩增过程实时监测。目前实时定量RT-PCR已经成为各个流感参考实验室检测技术列表中的标准配置。

从血象到血清学检测,再到RT-PCR以及病毒学检测,针对流感病毒的检测方法,由简到繁,层层推进,最终揪出流感真凶。不过实际应用中,这几种方法可能会同时使用,迅速准确地给出结果。魔高一尺,道高一丈,不断涌现出的新检测技术为公共卫生人员提供了"火眼金睛",虽然,狡猾的病毒不断"乔装打扮",但是它们在精密的检测仪器面前终将无处遁形。

(本文已刊于《科学世界》2009年6月号。)

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14 Responses to “流感元凶无处遁形”

  1. sweety_dream说道:

    沙发.希望流感快点结束...

  2. D说道:

    “据测算,只要标本中存在100个流感病毒的RNA分子(大约10-15克)”
    这是说10-15克标本中有100个病毒RNA,还是说100个病毒RNA就重达10-15克?按一般语义理解应该是后一种意思,然后我被吓倒了……RNA分子有这么重?

  3. perry说道:

    “(大约10-15克)“
    楼上,应该是“10的负15次方“克。

    • D说道:

      感谢回答。

      希望文中这个书写方式可以改一下,既然博客文字不能正确支持乘方格式显示,就不要写-表示了……当然,是说有修改权限的筒子们看见这条的话

  4. 张撞鹿说道:

    可能是我最近没有耐心,也可能是出于各种考虑而不敢下判断。市面上这么多关于这次流感的报道,科普的也好,社会新闻的也好,都没有让我弄明白,这个病毒和以前的流感病毒到底有何区别,这个区别使它多么危险。

    到目前,有没有统计学数据,或者其他方式来证明,这次流感比以前的流感更可怕,还是同一个量级?当然,我知道可能是没有的。

    这个问题不解决,我就没法判断,到底是我们现在反应过激,还是美国人太不重视。顺带着我也无法判断,这么声势浩大的“流感防治战”,包括许多人对于美国人的愤怒和对于病毒的看恐惧,再到对政府措施的赞美,到底是种幸运,还是被有意策划出来转移注意力的手段。

    • 史军说道:

      个人看法,这次的流感病毒就是一个流感基因重组的真实例子。虽然以前这种情况可能有很多,但是这是人们第一次如此近地观察到这种例子。这次的重组本身不可怕,但是人们担心的是可能会有更恐怖的组合出现。仅此而已。纯属个人观点。

    • 透露社母鸡说道:

      我觉得很容易判断啊

      至少在目前阶段,计算一下死亡率就可以了。。。
      所谓反应过度、太不重视,说的都是眼下对公众渲染的程度。。。
      这个渲染与死亡率的关系究竟是怎么样的

      另外一个参考轴是。。。
      其他高死亡率流行病,比如肺结核、手足口
      是否得到了相似的重视、、、

  5. perry说道:

    在对事情还不很了解时,用全幅精力对待应该不会错,掉以轻心会坏事。何况这个流感是有前科的。

    对比SARS那样在最初时的掉以轻心,我认为还是像目前这样处理比较妥当。

  6. 偷果果说道:

    嗯,套句老话,还是要坚持“预防为主,防治结合”

  7. 集市小猴说道:

    “除了检测病毒,鸡胚也是流感疫苗的重要生产场所。”————不能吃生鸡蛋,对不?

  8. hbchendl说道:

    血液中的线索一节:
    在外周血中,各种血细胞的形状及"所占"会随人的身体状况而发生变化

    这句话中的“所占”二字好别扭呀。

  9. BillLiv说道:

    科学的力量还是很强大的,人类研究大自然,本身就是为了得到利于自身发展的规律。

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